Etablierung und Einsatz eines Enzymimmunassays für Testosteron- , Östrogen- und Glukokortikoidmetaboliten im Kot europäischer Wölfe (Canis lupus) mit Lagerungsexperiment.
Establishment of an Enzyme-linked Immunosorbent Assay for measurements of testosterone,- estrogen- and glucocorticoidmetabolites in feces of the European wolf (Canis lupus) with a storage experiment.
Dr. med. vet. Dissertation
136 Seiten
Tierärztliche Hochschule Hannover
Wissenschaftliche Betreuung:
1. Prof. Dr. Michael Böer, Zoodirektor,Zoo Osnabrück
2. Univ.-Prof. Dr. A.-R. Günzel-Apel Reproduktionsmedizinische Einheit derKliniken, Klinik für Kleintiere
Zoo Osnabrück und andere Zoos und Tierpärke
Zusammenfassung:
Der Mythos Wolf ruft in vielen Menschen kontroverse Gefühle hervor, insbesondere seitdem sich der Wolf im Jahr 2000 wieder erfolgreich in Deutschland angesiedelt hat.
Um ein Monitoring der Wölfe in Deutschland zu ermöglichen, ist es unter anderem notwendig, nicht-invasiv Informationen über die Anzahl, den Gesundheitszustand und den Reproduktionsstand zu gewinnen, da der Wolf durch das Naturschutzgesetz geschützt ist. Daher war das Ziel dieser Studie, Enzymimmunassays (EIAs) zu validieren und einzusetzen, die es erlauben mittels nicht-invasiv gesammelter Kotproben die Gonadenfunktion (Androgene und Östrogene) sowie eine Aktivität der Hypothalamus-Hypophysen-Nebennierenrinden-Achse (HPA-Achse), welche eine Kortisolausschüttung ins Blut zur Folge hat, bei in Gehegen gehaltenen Wölfen nachzuweisen. Die zur Validierung der Androgene verwendeten Assays: 5α-Androstanolon, Epiandrosteron und Testosteron bewiesen sich alle als geeignet, um die Gonadenfunktion europäischer Wölfe zu erfassen, wobei der Testosteronassay die signifikantesten Ergebnisse im Vergleich der Validierungsgruppen: intakt/kastriert zeigte. Der verwendete Östradiol-17β-Assay war nicht geeignet, um Östrogenmetaboliten im Kot europäischer Wölfe nachzuweisen. Um einen Assay für Glukokortikoidmetaboliten zu validieren, wurde ein ACTH-Test mit drei europäischen Wölfen durchgeführt, welcher sich methodisch als nicht auswertbar erwies. Daher wurde zusätzlich ein ACTH-Test mit Blindstudie mit acht deutschen Schäferhunden durchgeführt und die Narkose eines europäischen Wolfs anhand von Kotproben vor und nach dem Eingriff überwacht. Der Kortikosteronassay (neben Kortisol, 3α,11ß-dihydroxy-CM und 11-Ketoetiocholanolon-Tulln) zeigte sich als am besten geeignet, um die HPA-Achsen-Aktivität europäischer Wölfe wiederzugeben. Um eine Aussage über das Geschlecht, den Reproduktionsstand sowie den Stressstatus treffen zu können, wurden die Ergebnisse der Tiere statistisch mit ihrem sozialen Rang und Geschlecht verglichen. Männliche Tiere hatten einen signifikant höheren Testosteronspiegel als Weibchen und auch die Alphatiere zeigten signifikant höhere Testosteronwerte als jene mittleren Ranges. Die Kortikosteronkonzentration im Kot von Omegatieren zeigte signifikant höhere Werte als jene mittleren Ranges. Diese Ergebnisse geben einen Hinweis darauf, dass eine Geschlechtsbestimmung anhand von Kotproben bei europäischen Wölfen möglich ist. Zudem ist festzuhalten, dass die rangniedrigsten Tiere den höchsten Stresslevel aufwiesen. Ein Zusammenhang zwischen Gehegegröße und GK-Werten wurde nicht gefunden.
Für das Lagerungsexperiment wurden frische Kotproben fraktioniert und eingefroren, um Konzentrationsveränderungen nach einer Lagerung von Proben zu untersuchen. Es wurden keine signifikanten Veränderungen der Hormonkonzentrationen im Laufe von vier Tagen festgestellt, jedoch lassen die hohen Standardabweichungen der einzelnen Proben vermuten, dass diese sehr stark in ihrem Hormongehalt schwanken können und möglichst nur frische Proben zur Hormonanalyse verwendet werden sollten.
Abstract:
The wolf provokes a lot of controverse feelings and especially since it’s resettlement in Germany in 2000 there are disputable public opinions towards repopulation of the wolf. It is essential for monitoring wolves to find methods which obtain information about their number, reproduction status and health non-invasivly especially because the wolf is protected by law. By analysing fecal samples, via enzymeimmunoassay (EIA), it might be possible to obtain these information non-invasivly. Due to this purpose, the aim of this study was, to establish and use an Enzyme-linked Immunosorbent Assay to get valid information about the gonadal status (androgens and estrogens) and the activity of the hypothalamic-pituitary-adrenomedullary-axis (HPA) of wolves in captivity. Stimulating the HPA-axis by any stressor, results in the excretion of cortisol into the bloodstream, allowing conclusions from measuring fecal cortisol metabolites referring to individual stress level health status. To identify individual assignment of samples individual defacation was observed and protocolled.
The assays used to validate androgens (5α-androstanolone, epiandrosterone und testosterone) have all been prooved to be valid to measure gonadal activity of European wolves because all of them showed significant differences between the intact and castrated wolves’ validation groups: testosterone-assays showed most significant results.
Validating the estradiol-17β-assay, prooved to be not suitable to detect estrogen metabolites in the feces of European wolves. To validate a glucocorticoid assay an ACTH-test was performed in three European wolves, which methodically showed no valuable results. Instead we performed another ACTH-test with six German Shepherds and an anesthesia of a wolf was surveilled by collecting fecal samples during and after the intervention. After analysing these fecal samples, the corticosterone-assay (in comparison to: cortisol, 3α,11ß-dihydroxy-CM und 11-ketoetiocholanolon-tulln) showed to be best suitable to detect an HPA-Axis activity in European wolves. To give any statement about sex, reproduction status or stress level, results of this study have been evaluated statistically by comparing the measured hormone-levels with social rank and sex. Male wolves had significantly higher testosterone-levels in their feces, than females and alpha-wolves showed significantly higher testosterone levels than middle-ranking ones. Corticosterone concentrations in feces of omega-wolves were significantly higher, than in middle-ranking ones. Results indicate, differentiating between male and female wolves to be possible by measuring testosterone concentrations in the feces by the EIA, validated in this study. Furthermore we conclude that omega-animals, that live in captivity, exhibit the highest stress level compared to higher ranking individuals. There was no correlation between enclosure size and stress level. No significant changes in hormone-concentrations over time (0, 24, 48, 72 and 94 hours after collection) werefound, but high standarddeviations of single samples suggest a variabilty within single samples, so that it is recommended to use only fresh samples for measuring hormone concentrations via EIA.
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